แม้ว่าทั้งห้องปลอดเชื้อในโรงพยาบาลและห้องปลอดเชื้อในห้องปฏิบัติการจะอาศัยระบบปิดที่สะอาดและระบบฟอกอากาศเพื่อรักษาระดับความสะอาด แต่ก็มีความแตกต่างกันอย่างมากในด้านวัตถุประสงค์การออกแบบ ตรรกะการแบ่งโซน การควบคุมการไหลของอากาศ ความแตกต่างของความดัน ขั้นตอนการทำงานของบุคลากร วัสดุ และมาตรฐานการยอมรับ ห้องปลอดเชื้อในโรงพยาบาลให้ความสำคัญกับความปลอดภัยของผู้ป่วยและการควบคุมการติดเชื้อ ในขณะที่ห้องปลอดเชื้อในห้องปฏิบัติการมุ่งเน้นไปที่การปกป้องตัวอย่าง ความน่าเชื่อถือของข้อมูล และการควบคุมอันตรายทางชีวภาพ ห้องปลอดเชื้อในโรงพยาบาล—รวมถึงห้องผ่าตัด ห้องคลอด ห้องไอซียู ศูนย์ผสมยาฉีดเข้าเส้นเลือด และแผนกอุปกรณ์ปลอดเชื้อ—ส่วนใหญ่จัดการกับความเสี่ยงที่เกิดจากจุลินทรีย์ที่ติดมากับมนุษย์ โดยมุ่งเน้นไปที่การควบคุมการแพร่กระจายของแบคทีเรียและอนุภาคจากบุคลากรเพื่อลดการติดเชื้อที่บริเวณผ่าตัด การแบ่งโซนจัดระเบียบตามขั้นตอนการทำงานทางคลินิก โดยแยกพื้นที่สะอาด กึ่งสะอาด และปนเปื้อนออกจากกันอย่างเคร่งครัด โซนสะอาดมักจะรักษาความดันบวกเมื่อเทียบกับสภาพแวดล้อมโดยรอบเพื่อป้องกันการแทรกซึมของสิ่งปนเปื้อนจากภายนอก ในขณะที่พื้นที่ผ่าตัดมักใช้การไหลของอากาศแบบลามินาร์เพื่อสร้างโซนป้องกันปลอดเชื้อเฉพาะที่ การเข้าออกของบุคลากรเกี่ยวข้องกับขั้นตอนการสวมชุดป้องกันและการใช้ระบบล็อกอากาศ และการเคลื่อนย้ายวัสดุจะทำผ่านช่องส่งผ่าน มาตรฐานที่เกี่ยวข้องมุ่งเน้นไปที่ห้องผ่าตัดที่สะอาดของโรงพยาบาลและข้อกำหนดด้านการควบคุมการติดเชื้อ การทดสอบให้ความสำคัญกับแบคทีเรียในอากาศ แบคทีเรียที่ตกค้าง ฝุ่นละออง และอุณหภูมิ/ความชื้น (โดยตั้งค่าให้เหมาะสมเพื่อความสะดวกสบาย โดยทั่วไปอยู่ที่ 22–26°C และความชื้น 40%–60%) วัสดุที่เลือกใช้มีคุณสมบัติในการต้านเชื้อแบคทีเรียและทนต่อการเช็ดทำความสะอาดซ้ำๆ ด้วยน้ำยาฆ่าเชื้อ (รวมถึงแอลกอฮอล์และสารที่มีคลอรีนเป็นส่วนประกอบ) เพื่อให้พื้นและผนังสามารถฆ่าเชื้อได้อย่างรวดเร็ว
ห้องปลอดเชื้อในห้องปฏิบัติการ เช่น ห้องปฏิบัติการ PCR ห้องปฏิบัติการจุลชีววิทยา ห้องเพาะเลี้ยงเซลล์ และห้องทดสอบความปลอดเชื้อ มีจุดมุ่งหมายเพื่อปกป้องตัวอย่างจากการปนเปื้อนจากภายนอก ในขณะเดียวกันก็ป้องกันการแพร่กระจายของเชื้อโรคภายใน ห้องเหล่านี้อาจทำงานภายใต้ความดันบวกหรือลบ ขึ้นอยู่กับระดับความปลอดภัยทางชีวภาพ ตัวอย่างเช่น ห้องปฏิบัติการ PCR จะถูกแบ่งโซนอย่างเข้มงวดเป็นพื้นที่เตรียมสารเคมี พื้นที่เตรียมตัวอย่าง และพื้นที่ผลิตภัณฑ์จากการขยายจำนวน โดยมีแรงดันไล่ระดับในทิศทางต่างๆ เพื่อให้มั่นใจว่าพื้นที่ผลิตภัณฑ์ยังคงมีความดันลบเพื่อป้องกันการปนเปื้อนข้ามจากผลิตภัณฑ์ที่ขยายจำนวนแล้ว ห้องปฏิบัติการความปลอดภัยทางชีวภาพให้ความสำคัญกับการควบคุมละอองชีวภาพที่เป็นอันตราย โดยมีการกำหนดทิศทางการไหลของอากาศจากโซนสะอาดไปยังโซนปนเปื้อน ระเบียบการสวมชุดป้องกันของบุคลากรนั้นเหนือกว่าระบบล็อกอากาศพื้นฐานของห้องปลอดเชื้อ ห้องปฏิบัติการระดับสูงอาจต้องการอุปกรณ์ป้องกันเพิ่มเติม และจำเป็นต้องมีทางเดินที่ปลอดภัยและเฉพาะเจาะจงสำหรับการกำจัดวัสดุที่ปนเปื้อน ของเสียที่เป็นของเหลว และของเสียที่เป็นของแข็ง มาตรฐานที่เกี่ยวข้องครอบคลุมถึงมาตรฐานสำหรับห้องปฏิบัติการความปลอดภัยทางชีวภาพและห้องปลอดเชื้อที่ใช้ในการทดสอบทางเภสัชกรรม นอกเหนือจากการควบคุมอนุภาคและจุลินทรีย์ตามมาตรฐานแล้ว ข้อกำหนดการทดสอบที่บังคับใช้ยังครอบคลุมถึงการควบคุมละอองลอย การกรองไอเสีย การเชื่อมต่อแรงดัน และการบำบัดก๊าซและของเหลวเสีย การตั้งค่าอุณหภูมิและความชื้นส่วนใหญ่จะถูกกำหนดโดยความต้องการของสารเคมีที่ใช้ในการทดลองและการเพาะเลี้ยงเซลล์ ซึ่งจำเป็นต้องมีช่วงการควบคุมที่เข้มงวดมากขึ้น ห้องเพาะเลี้ยงเซลล์บางห้องยังต้องการสภาพแวดล้อม CO₂ ที่คงที่ วัสดุต้องไม่เพียงแต่ทนต่อกระบวนการฆ่าเชื้อเท่านั้น แต่ยังต้องทนต่อการกัดกร่อนจากกรด ด่าง และตัวทำละลายอินทรีย์ด้วย
แม้ว่าการจัดประเภทความสะอาดจะมีความทับซ้อนกันอยู่บ้าง โดยทั้งห้องผ่าตัดในโรงพยาบาลและห้องปฏิบัติการปลอดเชื้อต่างก็สามารถบรรลุมาตรฐาน ISO Class 7 หรือ 8 ได้ แต่โดยพื้นฐานแล้วทั้งสองประเภทมีความแตกต่างกันในแง่ของทิศทางของแรงดันที่แตกต่างกัน วัตถุประสงค์ของการไหลของอากาศ และสารปนเปื้อนเฉพาะที่ถูกควบคุม ห้องปลอดเชื้อในโรงพยาบาลมีเป้าหมายเพื่อป้องกันจุลินทรีย์ที่มาจากบุคลากรไม่ให้ปนเปื้อนบริเวณผ่าตัด ในขณะที่ห้องปฏิบัติการปลอดเชื้อทางชีววิทยาเน้นการป้องกันการรั่วไหลของตัวอย่างทดลองและการปนเปื้อนข้ามระหว่างตัวอย่าง สถานการณ์หลายอย่างต้องการแรงดันลบ ซึ่งได้รับการสนับสนุนจากระบบระบายอากาศอิสระ ระบบกรองประสิทธิภาพสูง และระบบฆ่าเชื้อน้ำเสีย ตรรกะที่ควบคุมการไหลของบุคลากรและวัสดุแบบทิศทางเดียวก็แตกต่างกันเช่นกัน รูปแบบของโรงพยาบาลให้ความสำคัญกับการปกป้องผู้ป่วย ในขณะที่การออกแบบห้องปฏิบัติการจะสร้างสมดุลระหว่างการปกป้องตัวอย่างกับความปลอดภัยของบุคลากรที่ปฏิบัติงาน